當臨床應(yīng)用干細胞治療時，選擇哪個代次的干細胞治療更加合適，是經(jīng)常容易被問及的。這些都是應(yīng)該思考和有待解決的問題。我們都是知道，人分男女老少，而干細胞也有年輕和衰老之分，因此，細胞的代數(shù)是影響干細胞活性及臨床有效性、安全性的一個重要因素。

理論上講，細胞代數(shù)越靠前，干細胞的干性也越強。但是干細胞在體外培養(yǎng)的過程中，干細胞有從組織微環(huán)境到體外培養(yǎng)環(huán)境的一個調(diào)整和適應(yīng)過程，一部分不適應(yīng)的細胞會被淘汰，所以在前兩三代，干細胞基因組有著不穩(wěn)定的因素，可能不宜臨床應(yīng)用。

有研究顯示，通過核型分析發(fā)現(xiàn)，在前三代細胞中，干細胞存在異常核型的比例偏高。就如間充質(zhì)干細胞（MSC）而言，臨床應(yīng)用的最佳代數(shù)應(yīng)該在 4~6 代。

目前臨床研究中，MSC 應(yīng)用較為常見的來源骨髓、脂肪、臍帶、胎盤等，本文以臍帶、脂肪、胎盤這三類比較常見的來源進行總結(jié)，針對不同來源間充質(zhì)干細胞，體外傳代培養(yǎng)后不同代次的一些生物學特性的變化（例如：細胞形態(tài)、細胞周期檢測、表面標記物檢測、染色體核型分析、相關(guān)基因表達及細胞因子的定量分析），因可供參考資料有限，不足之處請諒解。

細胞傳代

體外培養(yǎng)時，細胞在培養(yǎng)瓶中的生長過程主要分為 4 個階段（如下圖）：

首先是延滯期，細胞接種到培養(yǎng)瓶后，起始的一段時間內(nèi)是不增殖的，細胞數(shù)量保持不變。此階段，細胞需要時間來適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境；另外，進行細胞分裂之前，細胞內(nèi)各成分（例如遺傳物質(zhì)）的復制與裝配等也需要時間。

過了延滯期后，細胞開始分裂，進入對數(shù)生長期。此階段，細胞數(shù)量急速增加。

細胞數(shù)量增加到一定程度時，細胞相互接觸，產(chǎn)生接觸抑制，細胞分裂生長速度減慢，直至完全停止生長，進入穩(wěn)定期。

進入穩(wěn)定期后，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗，有害代謝產(chǎn)物積聚，細胞死亡數(shù)逐漸增加，進入衰亡期。

因此，為了避免大規(guī)模細胞死亡，細胞在進入穩(wěn)定期時應(yīng)及時消化，并重新接種到新的培養(yǎng)瓶中，這稱為細胞傳代。

從胎盤、臍帶和脂肪其他組織中分離干細胞進行培養(yǎng)，稱為原代培養(yǎng)，這一階段的細胞為原代細胞（0 代）。原代細胞充滿后，將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，這是第 1 代。在第 1 代細胞長滿后，將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，這是第 2 代；第 2 代細胞充滿后，將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，即第 3 代細胞，依此類推。

胎盤間充質(zhì)干細胞

足月胎盤是胎兒出生后的廢物，易于獲取，數(shù)量大，體積大，研究成本低，不涉及社會、倫理等問題。此外，胎盤間充質(zhì)干細胞具有與骨髓間充質(zhì)細胞相似的功能和特性，并且在增殖方面優(yōu)于骨髓間充干細胞，可以大大增加間充質(zhì)造血干細胞的數(shù)量。

一些研究分別測試了第 5、第 10 和第 15 代細胞的增殖能力。結(jié)果表明，第 5 代間充質(zhì)干細胞的增殖能力顯著高于第 10 和第 15 代細胞。實驗結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)胎盤間充質(zhì)干細胞時，細胞會隨著細胞代次的增加而逐漸老化。由于第 5 代后胎盤干間充質(zhì)細胞的增殖能力會逐漸下降，因此最好選擇第 5 代以下的間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)，作為臨床應(yīng)用。

注：胎盤間充質(zhì)干細胞鏡下形態(tài)

圖 A 為細胞貼壁后形態(tài)均一，呈長梭形，平行或漩渦狀生長（×100）；

圖 B 為第 25 代細胞形態(tài)呈鋪路石樣改變（40×4）。

注：胎盤間充質(zhì)干細胞生長曲線、增殖能力及傳代結(jié)果

圖 A 為第 5 代細胞的倍增時間明顯短于第 10 代和第 15 代細胞的倍增時間；

圖 B 為不同代次的胎盤間充質(zhì)干細胞增殖能力不同，第 5 代增殖能力明顯高于第 10 和第 15 代，與第 5 代比，aP<0.01，bP<0.001，與第 10 代比，c<0.05；

圖 C 為胎盤間充質(zhì)干細胞 5 例標本傳至 25 代，無貼壁細胞或貼壁不牢，但增殖速度快。

在這項研究中，胎盤間充質(zhì)干細胞可以長期傳代培養(yǎng)到第 25 代。不同代次的胎盤間充質(zhì)干細胞增殖能力不同，第 5 代的增殖能力顯著高于第 10 代和第 15 代，這表明在臨床應(yīng)用前使用第 5 代是合適的。

臍帶間充質(zhì)干細胞

在各種來源的間充質(zhì)干細胞中，人臍帶源性間充質(zhì)細胞（hUC-MSCs）作為一種更“年輕”的成人間充質(zhì)造血干細胞，因其綜合優(yōu)勢而受到越來越多的關(guān)注。

人臍帶間充質(zhì)干細胞的基本生物學特性，如細胞表面免疫標記物和誘導的多潛能分化潛能，在長期體外培養(yǎng)后沒有顯著變化。長期培養(yǎng) 20 代后，未發(fā)現(xiàn)致病或致瘤基因變異。高傳代（P20）hUC-MSCs 與早期低傳代（P5）hUC-MSCs 的細胞增殖活性和端粒酶活性無顯著差異。隨著培養(yǎng)傳代次數(shù)的增加，細胞開始老化，尤其是第 20 代細胞。

注：不同代次人臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察

hUC-MSCs 在體外培養(yǎng)的第 5 代和第 10 代中顯示出相同的細胞形態(tài)和生長模式，顯示出長梭狀貼壁生長和輕微螺旋流動排列。第 20 代細胞表現(xiàn)出非常相似的長梭形貼壁生長，但細胞體略有擴大，融合后局部排列紊亂。

已經(jīng)表明，盡管在高傳代培養(yǎng)中 hUC-MSCs 的核型保持穩(wěn)定，但在第 7 代中端粒酶活性將下降。通過檢測人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性亞基基因的表達，我們發(fā)現(xiàn)第 5 代、第 10 代和第 20 代 hUC- MSCs 的端粒酶活性沒有顯著差異；不同世代的細胞表現(xiàn)出相似的生長和增殖曲線，表明它們的細胞增殖活性沒有差異。

注：不同代次人臍帶間充質(zhì)干細胞的增殖活性檢測

總之，盡管第 20 代 hUC-MSCs 仍然保持了與低代細胞相似的干細胞的生物學特性、基因穩(wěn)定性和生長特性，但隨著傳代培養(yǎng)時間的延長，細胞開始顯示出一定程度的老化。鑒于過度傳代導致的 hUC-MSCs 老化跡象，建議用于臨床干細胞治療的 hUC-MSCs 體外培養(yǎng)不應(yīng)超過第 10 代。

脂肪間充質(zhì)干細胞

脂肪間充質(zhì)干細胞（ADSCs）是脂肪組織中的多能干細胞。它的免疫原性很低，體外擴增相對容易。這些優(yōu)點使其在組織工程、創(chuàng)傷修復和基因治療中具有良好的應(yīng)用前景。

在一些研究中，ADSCs 在體外培養(yǎng)至第 1、第 3、第 5、第 7、第 10、第 14 和第 15 代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 ADSCs 傳代至第 7 代后，細胞的增殖速率開始減慢，并且在 10 代后細胞的增殖速度顯著減慢。細胞呈長梭形，保持穩(wěn)定。

注：細胞形態(tài)觀察

注：細胞因子定量分析

研究表明，脂肪來源的間充質(zhì)干細胞（在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)）的生物學和遺傳特性基本穩(wěn)定，在傳代至第 5 代期間沒有顯著變化。初步揭示，脂肪來源的間充質(zhì)干細胞在體外傳代至第 5 代后可以安全使用。

從上述研究中不難看出，間充質(zhì)干細胞在理論上可以長期傳代培養(yǎng)，但在臨床應(yīng)用中不建議選擇代次較高的干細胞。未在體外擴增的 MSCs 是安全無害的，除非它們有一些遺傳缺陷，否則體外擴增的最大風險是基因突變。一個研究團隊發(fā)現(xiàn)，當骨髓 MSC 在體外培養(yǎng)到第 18 代時，發(fā)生了基因突變和染色體異常。大量其他研究證實，只有當體外培養(yǎng)代數(shù)過高（超過 10 代）時，MSC 才會導致染色體異常。

影響干細胞回輸安全性的另一個問題是添加劑，例如使用無血清培養(yǎng)基代替動物血清進行培養(yǎng)；通過嚴格的無菌操作避免使用抗生素。然而，對于細胞培養(yǎng)中不可替代的成分，如胰蛋白酶，在回輸過程中嚴格檢查質(zhì)量以確保沒有殘留成分也是至關(guān)重要的。

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